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建设厅电工证查询网站官方网,企业查查官网入口官网,国外设计网站,工厂网站开发01 研究背景子宫内膜癌中LATS1/2的高频突变与MHC-I表达下调的关联#xff0c;提示了这两个Hippo通路核心激酶可能参与了免疫调控。然而#xff0c;传统认知中LATS1/2主要通过磷酸化YAP/TAZ发挥作用#xff0c;其是否以及如何调控MHC-I表达完全未知。STAT1作为干扰素信号通路…01研究背景子宫内膜癌中LATS1/2的高频突变与MHC-I表达下调的关联提示了这两个Hippo通路核心激酶可能参与了免疫调控。然而传统认知中LATS1/2主要通过磷酸化YAP/TAZ发挥作用其是否以及如何调控MHC-I表达完全未知。STAT1作为干扰素信号通路的核心转录因子已知可被JAK1/2磷酸化Tyr701但其Ser727的磷酸化调控机制一直不明确。这两条线索交汇催生了一个关键科学问题LATS1/2是否直接磷酸化STAT1从而影响MHC-I的表达02验证策略第一步建立互作关系细胞层面证据。研究团队首先在细胞环境中验证了LATS1/2与STAT1的物理相互作用。内源性互作在KLE子宫内膜癌细胞中使用特异性抗体成功共沉淀出内源性LATS1/2-STAT1复合物外源性验证293T过表达系统中FLAG-LATS1/2与MYC-STAT1的双向免疫共沉淀确认互作特异性排除间接效应后续的GST pull-down实验证明这种互作是直接的无需其他哺乳动物蛋白辅助。第二步功能相关性验证细胞表型关联。磷酸化水平检测LATS1/2敲除显著降低细胞内STAT1 Ser727的基础及干扰素γ诱导的磷酸化水平功能挽救实验回补野生型LATS1/2可恢复磷酸化而激酶死亡突变体无效抑制剂验证LATS1/2特异性抑制剂TDI-011536处理产生类似敲除效果。图1 验证LATS1/2可催化STAT1蛋白磷酸化Yang et al., 2025。03 核心突破体外激酶实验的设计与执行1.蛋白制备策略激酶选择表达纯化LATS1/2的催化结构域LATS1: 589-1130aaLATS2: 480-1088aa确保激酶活性底物设计采用STAT1全长蛋白及分段策略N端1-650aaC端650-750aa精确定位磷酸化区域2.反应体系优化标准激酶缓冲液20mM Tris-HCl (pH 7.5)5mM MgCl₂5mM MnCl₂2mM DTTATP浓度10μM生理相关浓度反应条件30℃孵育30分钟确保线性反应阶段3.磷酸化位点鉴定1质谱分析将反应产物进行LC-MS/MS分析鉴定到C端肽段TALISPMGSPRS727磷酸化首次发现N端肽段VLDGSLQEIQRS532磷酸化2免疫印迹验证使用p-STAT1S727特异性抗体只有当LATS1/2存在时STAT1的S727位点才发生磷酸化。参考文献1、Yang Q, Lv Z, Wang M, et al. LATS1/2 loss promote tumor immune evasion in endometrial cancer through downregulating MHC-I expression[J].Journal of Experimental Clinical Cancer Research, 2024, 43(1): 54.